超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞及其对细胞活性的影响

Experimental study on cell viability of SPIOlabeled myoblasts

LI Junxia, ZHANG Zhuoli, ZHANG Li, et al.

【Abstract】

Objective：To investigate the biological characteristics of superparamagnetic iron oxides(SPIO) labeled myoblasts in vitro.Methods  The cultures of myoblasts from rat were used.Myoblasts were labeled with SPIO agent using liposome transfection agent.Labeling efficiency was measured by light microscopy.For evaluating the toxicity and cell viability of various concentrations of SPIO labeled myoblasts.MTT and JC1 was used.Results   Prussian blue staining confirmediron uptake and showed 100％ labeling efficiency.With the concentration of SPIO increasing(5.6 μg/ml～44.8 μg/ml)，there was no obvious difference in cell viability of myoblasts(P＞0.05).When the concentration of SPIO exceeded 89.6 μg/ml，there was a significant difference(P＜0.01).Conclusions   SPIO levels are closely correlated with the biological characteristics of myoblasts.Low density of SPIO has no obvious effect on the toxicity and cell viability of SPIOlabeled myoblasts.Myoblastst labeled with SPIO can be tracked by MRI microscopy in clinical scanners.

【Key words】

myoblastst; superparamagnetic iron oxide; magnetic labeled cells; cell viability

　细胞移植是改善和缓解终末期缺血性心脏病的较好手段［1］。但目前移植细胞在体内的增殖、分化信息尚不明确。MR显微成像是最近出现的显微影像技术，具有较高的分辨率，能够分辨近似于细胞大小的组织

［2］，能够动态跟踪移植细胞。但目标细胞必须经MR对比剂标记后才能与背景组织区别而被MR检测。超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic oxide iron particle:SPIO)是一种新型磁共振对比剂，本研究探讨SPIO标记成肌细胞方法及其对细胞活性的影响，为临床应用磁共振显像提供依据。

　1   材料与方法

1.1   材料   SD大鼠乳鼠(出生3 d以内)20只，雌雄不限，由第四军医大学实验动物中心提供。DMEM培养基、小牛血清(FBS)、脂质体2000、JC1(Molecular probes)均为美国Gibco公司产品。Endorem:SPIO市售制剂，11.2 mg Fe/ml)，由荷兰鹿特丹Erasmus大学医学中心放射线科张卓立博士后提供。CO2培养箱、光学显微镜、流式细胞仪。

1.2   方法

1.2.1   成肌细胞分离培养   将出生3 d乳鼠颈椎脱位法处死，无菌条件下取双下肢肌肉，DHanks液洗去残血，祛除筋膜等周围组织，用含抗生素的无血清培养液冲洗2次，剪成约1 mm3大小肌肉碎块，无血清培养液冲洗2次，静置1 min并弃去上层液及飘浮组织，加5倍体积0.2％ Ⅰ型胶原酶，37℃水浴消化50 min，2 000 r/min离心10 min，去上清液，底层细胞和碎片用DMEM洗2次，制成骨骼肌单细胞悬液，再加5倍体积0.25％胰蛋白酶，37℃水浴消化30 min，释放位于骨骼肌肌膜的成肌细胞，加入15％FBS的DMEM培养液8 ml阻止酶消化，2 700 r/min离心10 min，去上清，重悬细胞离心去上清，反复4次，最后1次用2 ml不含FBS的DMEM重悬细胞，采用Percoll(细胞分离液)非连续密度梯度离心法除去成纤维细胞，将所得细胞加入15％FBS的DMEM培养基中，吹匀、计数，接种于内置处理过的盖玻片的培养板中。

1.2.2   脂质体包被SPIO方法   30 μl脂质体2000稀释于0.5 ml OptiMEM血清培养基中为管1，不同剂量的Endorem(SPIO)稀释于0.5 ml OptiMEM血清培养基中为管2，5 min后混合管1及管2于室温放置20 min，获得脂质包被SPIO的混悬液。

1.2.3   SPIO标记成肌细胞及分组   提取传代(第二代)后第2天生长较活跃的成肌细胞，将不同浓度的脂质体包被SPIO混合液分别加入含1×106成肌细胞的9 ml OptiMEM中，不同组别SPIO的浓度分别为5.6、11.2、22.4、44.8及89.6 μg Fe/ml，37℃、5％ CO2培养箱中共同培养23 h，即可得不同浓度SPIO标记的成肌细胞(不同浓度的组别)。另设未标记的成肌细胞为对照组。

1.2.4   SPIO标记的检测   光学显微镜检测：利用普鲁士蓝可使SPIO铁离子染色并在普通光学显微镜下可以观察到的特点，用普鲁士蓝对脂质体包被SPIO标记的成肌细胞进行染色。具体方法为：将标记成肌细胞移入内置处理过的盖玻片的六孔培养板中。1 h后待细胞充分贴壁后，取出盖玻片，DHanks液洗涤3次，4％多聚甲醛固定20 min，蒸馏水洗涤3遍，0.5％伊红复染3 min，蒸馏水洗去多余的伊红，光学显微镜观察SPIO在细胞内的位置、标记率，每个样本进行多视野计数至少500个细胞。电镜检测：消化收集标记移植细胞，吸去培养基后以2.5％戊二醛4℃固定15 min，离心(2 000 r/min，10 min)收集细胞，2.5％戊二醛、1％锇酸固定。梯度乙醇脱水、包埋，超薄切片，铀-铅双染，透射电镜观察并摄片。